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La cuantificación total de proteínas es un paso esencial en experimentos que involucran el aislamiento, separación y análisis bioquímico de proteínas. Existen una variedad de métodos cuantitativos como ensayos de absorbancia UV, ensayos que involucran reacciones químicas y métodos de inmuno detección.
Cada una de estas tecnologías de cuantificación de proteínas tiene beneficios únicos y la idoneidad del ensayo depende del tipo de muestra y / o volumen que esté disponible para el análisis. Por ejemplo, algunos de los ensayos a base de colorantes pueden interferir con los productos químicos que se encuentran en las preparaciones tampón y un ensayo alternativo puede ser más apropiado. Los científicos deben considerar las limitaciones de cada ensayo para determinar cuál es la mejor opción para su muestra.
El método más simple y directo para determinar la concentración de proteína en una solución es medir la absorbancia ultravioleta (UV). Los aminoácidos con cadenas laterales aromáticas (triptófano, tirosina, etc.) proporcionan a las proteínas su absorbancia UV distintiva a 280 nm. Debido a que estos aminoácidos absorben la luz UV a 280 nm, la absorbancia en esta longitud de onda particular se puede obtener a través de un espectrofotómetro y se utiliza para estimar las concentraciones de proteínas en las muestras.
Si bien simple, el uso de la absorbancia UV para la concentración de proteínas puede tener una alta variabilidad porque los componentes no proteicos en una muestra pueden interferir con las mediciones de absorbancia. Además, las mezclas con diferentes proteínas en una muestra podrían causar lecturas de absorbancia variables debido a la diferencia en las composiciones de aminoácidos.
Los ensayos basados en reactivos superan los problemas de compatibilidad que se observan con los métodos de absorbancia UV. Los ejemplos de ensayos basados en reactivos para la cuantificación de proteínas incluyen aquellos que utilizan métodos colorimétricos, como el ácido bicinconinico (BCA), Lowry y los ensayos de Bradford.
El método BCA y el método Lowry implican la formación de un complejo cobre-proteína. Estos son ensayos sensibles y son menos variables que el ensayo de Bradford. Sin embargo, el ensayo de Bradford es rápido, fácil de realizar y es compatible con ciertos agentes reductores, a diferencia de los ensayos de BCA y Lowry.
No existe un método ideal para la cuantificación de proteínas en solución. Cada método tiene sus ventajas y desventajas y la elección se basa en la compatibilidad del ensayo con la muestra que se quiere determinar.
Consultá las sustancias incompatibles con el ensayo de BCA y con el ensayo de Bradford.
Criterios importantes para la elección del ensayo:
-Compatibilidad del ensayo con el tipo de muestra y sus componentes
-Rango de detección y cantidad de muestra requerida
-Tiempo estimado y disponibilidad de equipamiento
Es común incorporar agentes reductores (por ejemplo DTT) y detergentes (como el Tritón X-100) a una solución proteica para cumplir con los objetivos de ciertos ensayos. En general, el método de Bradford es muy utilizado para muestras que contienen agentes reductores ya que este método no demuestra incompatibilidad en este tipo de muestra. Para muestras que contienen detergentes, es común utilizar métodos basados en la formación de complejos cobre-proteína como el método de BCA, que no demuestran inhibición en presencia de bajas cantidades de detergentes
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